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CAPITULO 2»

LAS MICROALGAS, FUENTE DE ACEITE

PARA LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL
Luz Marina Flórez Pardo1
José Luis López Velasco1
Jorge Enrique López Galán 2

2.1 CONTEXTO GENERAL SOBRE LOS BIOCOMBUSTIBLES

El "nacimiento" de los biocombustibles, vino a dar "luces" sobre una forma renovable para
la producción de combustibles para trasporte y producción de energía de forma renovable,
sin embargo este pasaje preliminar fue empañado por el uso indebido de tierras de cultivo y
el uso de cosechas alimenticias para desplazarlas en la producción de aditivos a los combus-
tibles de origen petrolero. En el caso particular del biodiesel obtenido de fuentes de primera
generación, cuya producción depende de aceites vegetales como palma, soya y cañóla, la
discusión se centra en los impactos generados sobre los bosques primarios, secundarios y
aún terciarios, la biodiversidad y el costo del aceite comestible.

En una segunda instancia, se da lugar a los biocombustibles de segunda generación proce-

dentes de biomasa. Estos combustibles se producen con muy poco impacto sobre las tierras
cultivables y sus "desechos" son de gran utilidad en múltiples campos, lo que ha venido a
generar el nuevo concepto de "biorefinería". Sobre estos biocombustibles se ha generado
una gran especulación, por ello se hace necesario una revisión exhaustiva de lo publicado
hasta el momento sobre las diferentes especies, técnicas y tecnologías que se han adecuado
a fin de hacer de los combustibles de segunda generación una realidad comprometida con
los principios de ser "sostenible", viable económicamente y positivamente impactante a
nivel social.

En Colombia, según algunos estudios hechos por el Departamento de Planeación Nacional,

los actuales y proyectados cultivos de palma africana no alcanzan a satisfacer la demanda
de biodiesel para la mezcla B20 (20% de biodiesel, 80% de diesel) que se espera empiece a

' Universidad Autónoma de Occidente. Grupo de Investigación en Biocombustibles (GRUBIOC), CU 25 # 115 - 85 Km. 2 I- ia Cali
-jamundí. Cali, Colombia. E-mail:[email protected]
2 Universidad del Valle, Grupo de Investigación en Biocombustibles (GRUBIOC), A.A. 25360 PBX +57 2 3212100.

E-mail: jetopetó, univalle. edil, co

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operar desde el 2012, sobre todo por el largo tiempo de estabilización productiva (7 añ<
las plantaciones, lo que guía los estudios hacia otras materias primas. Entre éstas, las micro«
lgas (biocombustibles de segunda generación) presentan grandes ventajas: corto tiempi
de producción de biomasa [1, 2], adaptabilidad a diferentes medios de cultivo, diversidad
metabòlica y uso eficiente del volumen en vez del área para su producción.

2.2. LAS MICROALGAS

Las microalgas como microorganismos eucariotas fotosintéticos son capaces
mar la energía luminosa en energía química con una eficiencia cuatro veces superior a la d
las plantas [3], Los cultivos de microalgas son identificados mundialmente como fuentes d
proteínas, grasas, carbohidratos y vitaminas, las que varían según la especie de que se tra
[4], Por ejemplo, los cultivos de la microalga Chiarella sp. contiene diversas vitaminas, lo CUÍ
favorece el valor nutricional de su biomasa [5], En esta última, además de carotenoides, ha
también tiamina, ribofalvina, priridoxina, cobalamina, biotina, ácidos pantoténico y àcidi
nicotinico [4].

El uso más extendido de las microalgas sin embargo es como base de la cadena trófica e:
la acuicultura, ya que son necesarias para el alimento de larvas de peces y crustáceos en su
primeros estadios, directamente o bien como alimento de las presas vivas que se utiliza:
en los distintos estadios larvarios. Son una fuente potencial de proteína para su uso en al:
mentación humana y animal, capaces de secuestrar el C 0 2 que se libera a la atmósfera p
parte de las actividades humanas y pueden ser utilizadas en la purificación de efluentes
para la producción de biofitel [6]. La importancia de las microalgas se debe a que produce
una amplia variedad de compuestos de interés biotecnológico, algunos de los cuales son ir
dispensables para el crecimiento animal. Entre estos compuestos destacan los ácidos gras
poliinsaturados de cadena larga.

Los resultados obtenidos en estudios bioquímicos y nutricionales donde se utilizan cultiv

de microalgas (Chlorella sp. para el caso) como suplemento alimenticio, demuestran que est
algas pueden sustituir fuentes alimenticias comunes, afirmaciones que vienen de investiga
dones iniciadas en los años 70 [7, 8]. No obstante lo anterior, el contenido vitaminico y s
bioquímica general, depende del genotipo (la especies y variedad), el estadio del ciclo de ere
cimiento, el estado nutricional, la intensidad de luz y otros factores que alteran el desarroll
de las microalgas y su metabolismo, sin excluir las modificaciones que se hagan en su medi
de cultivo (control metabòlico), selección celular y otros. Aún con todas estas aplicacione
se ha encontrado que su uso a nivel industrial es muy limitado y son pocas las especies e
uso como las diatomeas Chaetoceros y Thalassiosira, la haptofita Jsochrysis, la eustigmatofit
N'annochloropss y la prasinofita Tetraselmis, Chaetoceros muelleri, C. calátrans, Isochrysis sp., Tetras
mis suecica, T. chui y Dunaliella tertiolecta [9,10],

• I 44 | ,
2.3. COMPOSICIÓN DE ÁCIDOS GRASOS EN MICROALGAS
Los ácidos grasos tienen un alto potencial de aplicaciones. Los aceites de las algas tienen
composiciones similares a la de los demás aceites vegetales utilizados, y en el futuro podrían
ser usados masivamente en alimentación. Los lípidos y ácidos grasos contenidos en las mi-
croalgas varían de acuerdo a ciertas condiciones de cultivo, en algunos casos, el contenido
lipídico puede ser incrementado por la imposición de un régimen austero de nitrógeno, su-
ministrando sólo una pequeña parte de sales nutritivas nitrogenadas (como máximo 1 % del
medio de cultivo) u otros factores de estrés celular. Desde la década del 40 se ha encontrado
que las fracciones lipídicas llegaban a 75 — 80 % de su peso en base seca, lo que supera por
mucho a gran cantidad de especies terrestres, por ejemplo, el alga verde Chorellapyreneidosa
y algunas diatomeas (por ejemplo Nit^cbia spp.) pueden almacenar un máximo de 70 - 80 %
y 42 % de su peso seco como grasa, respectivamente.

Las microalgas contienen ácidos grasos en los componentes de sus membranas y en sus
fuentes de reserva. La mayor parte de los ácidos grasos acumulados por diferentes cepas
de microalgas son especies poüinsaturadas [5]. La producción de ácidos grasos poli-insatu-
rados a partir de microalgas presenta grandes ventajas alimenticias frente a otras fuentes:
hace posible alcanzar niveles de producción elevados en condiciones altamente controladas
y con un bajo riesgo de contaminación; es una actividad de una baja demanda de energía
que no requiere suelo fértil ni agua de calidad, no compite, por tanto, con otras actividades
agrarias. En la actualidad ciertas microalgas son la base de una floreciente industria biotec-
nológica. Crypthecodinuim cohnii, un dinoflagelado marino heterotrófico, es uno de los princi-
pales productores del ácido w-3 DHA (w-3 ácido docohexadecanoico). Los ácidos grasos
poli-insaturados son esenciales en la nutrición, pues estos no son sintetizados por las células
mímales; los más importantes en nutrición son los ácidos alfa-linolénico (AAL: parte de
los ácidos grasos omega-3) y linoleico (parte de los omega-6), y sus derivados, los ácidos
araquidónico (AA), eicosapentanoico (EPA) y docohexadecanoico (DHA).

En términos biológicos, los ácidos grasos de microalgas resultan ser ideales para el consumo
y su relativa capacidad de adaptación y nivel de producción, es ideal, pero las características
de sus enlaces químicos hace de estos aceites especies altamente susceptibles de oxidación,
lo que como consecuencia disminuye su estabilidad luego de ser transesterificado, disminu-
yendo sus posibilidades de almacenaje. Sin embargo, el proceso de "Hidrogenación catalíti-
ca" puede modificar el nivel de saturación de los ácidos grasos; no obstante, las condiciones
de operación para este tipo de ácidos grasos aún no han sido ensayadas.

Otro inconveniente que tienen los ácidos grasos es que varía su perfil de acuerdo con las
condiciones ambientales. En dos laboratorios comerciales de Sinaloa (México) que pertene-
cen a la misma compañía y que poseen condiciones de cultivo similares (sistemas y medios

^ ^ • • • • • • • • • k | 45 | mmmmmmmmmmmmm^^^^^^^m
nutritivos) se registraron diferencias en la composición proximal de Chaetoceros nmelleri. Li
magnitud de las diferencias abarcó el contenido de proteínas, lípidos y carbohidratos, como
también su rendimiento en forma de biomasa [10], dichas diferencias son posiblemente
debidas tanto a las diferentes rutinas como a los respectivos diseños de los sistemas de
producción (laboratorio 1: 2.5 m 3 y laboratorio 2: 4.0 m3), así como también a variaciones
climáticas y a la escala industrial implicada en el proceso.

2.4. AVANCES EN EL CULTIVO DE MICROALGAS

En el mundo, la producción de microalgas se realiza de acuerdo con los procedimientos de
cultivo encontrados como óptimos durante la época más fuerte de la acuicultura (la década
de los 70), con el sistema de carrusel, para cultivar en forma masiva diferentes tipos larva-
les, al igual que en aplicaciones para alimento humano [11] y producción de fármacos; si
embargo, los datos sobre densidades celulares, crecimiento y composición proximal (con-
tenido de lípidos, carbohidratos y proteínas) varía mucho de acuerdo a toda una serie d
condiciones físico-químicas reinantes (temperatura, salinidad, pH, luz, aireación y sustratos
para medios de cultivo, etc.) [12, 13], Todo esto incide sobre los costos, que pueden variai
de forma equivalente desde U$4-20/kg m ^^ en condiciones a cielo abierto y en laeo;
o estanques (básicamente recolección con inoculación previa) [5] a U$ 50-400/kg
en condiciones semi-controladas para los criaderos de bivalvos [14]. Estas variaciones s
presentan por la forma de cultivo, los sustratos para enriquecer los medios de cultivo y
tipo de microalga; así también, varía la composición lipídica por los factores anteriorment
mencionados, siendo ésta de crucial interés en términos energéticos; es decir, son muchos
los factores a tener en cuenta para maximizar la producción de lípidos. Algunos de ellos s
presentan a continuación

2.4.1. MEDIOS DE CULTIVO (SUSTRATOS PARA SU ELABORACIÓN)

El uso de los medios de cultivo sintéticos ha incrementado sustancialmente el valor econó
mico para la producción de la biomasa de microalgas [15]. En un intento de incrementa)
la síntesis de lípidos, las microalgas han sido sometidas a estrés fisiológico por la limitado
de nutrientes tales como nitrógeno, fósforo y silicio [16]. Estudios relativamente nuevos
han ensayado el uso de sustratos alternativos y no convencionales como medios de cultivo
destacando: fertilizantes agrícolas, residuales pesqueros, gas oil y exudados gomosos pan
el crecimiento y desarrollo de Isochrysis a f f . galbana var. tahitiana, Chaetocerosgracilis, Chaetocero.
sp. Prototheca %opfii y Chlorella sp. [15, 17, 18, 19], Se destaca que a partir de estos medios in-
novadores se han obtenido resultados comparables y superiores a los correspondientes £
los medios sintéticos. Se ha ensayado con éxito el uso de los exudados gomosos de Yabc
(Cercidiun praecox), cedro (Cedrela ocio rata) y mangle blanco (Laguncularia racemosá) comc
medios de cultivo para hongos patógenos; y del exudado gomoso de úveda {Acacia tortuosa)
para determinar el crecimiento mixotrófico de Chlorella sp. [20, 21, 18], Otros sustratos

«man
. jiivcMi^auvu^ en i.i Pr<iducciui Biucombustibles

lo constituyen el uso de la suspensión de gallinaza y el uso del sobrenadante del tanque de

succión de la planta de biogás, con 3 - 5 días de retención, lo que puede disminuir los costos
de producción de la biomasa a tasas similares de crecimiento [22],

Al hacer uso de fertilizantes agrícolas o desechos de la industria agropecuaria, ciertos ele-

mentos minerales pueden afectar positivamente la producción de biomasa en los cultivos de
microalgas [23, 24, 25, 26]; este es el caso de los materiales de origen zeolítico que aportan
fundamentalmente nitrógeno en forma de nitratos y nitritos, sílice y otros minerales [24],

2.4.2. CO-CULTIVOS
En ambientes acuáticos naturales o artificiales, marinos o de agua dulce, las microalgas están
siempre asociadas a bacterias [27]. Sin embargo, no se sabe si tales bacterias son asociativas,
promotoras de crecimiento, simbiontes o simplemente coexisten con la microalga (como los
saprofitos en ambientes terrestres). En el camino de verificar el tipo de asociación presente
entre microalgas-bacterias, el uso de procariotas que promueven el crecimiento en plantas
terrestres, como las pertenecientes al género A^ospinllum, han sido incluidas en estudios de
crecimiento microalgal. Inmovilizadas en alginato, bacterias del género A^ospirillum con la
microalgas del género Chlorella, se han obtenido resultados positivos en el mejoramiento de
los parámetros de crecimiento, incluidos biomasa y densidad celular [28] y con anterioridad
se ha reportado incremento en el contenido de lípidos [29], importante aporte en el área
de las microalgas con fines energéticos. A pesar de los avances logrados en este tema, los
mecanismos de acción y otras interacciones de inhibición de crecimiento encontradas, dejan
entrever lo poco entendidos que están los mecanismos de estas interacciones, de tal forma
}ue las investigaciones deban dirigirse a aumentar los conocimientos de forma elemental
'ensayo error de cultivos mixtos), incluir el orden fisiológico y molecular de estas interac-
;iones [2]

2.4.3. MODIFICACIONES DEBIDAS A ESTRÉS ALIMENTICIO Y A OTROS

FACTORES
Muchos estudios han explorado los posibles métodos de mejorar el contenido y calidad de
os lípidos en diversas diatomeas. Las deficiencias de ciertos nutrientes, como el silicio o
íitrógeno, han demostrado que alteran el metabolismo lipídico en algunas diatomeas [30,
51],

JA acumulación de lípidos en microalgas, especialmente de ácidos grasos, en condiciones de

3aja disponibilidad de nitrógeno, ya había sido descrita con anterioridad [32], atribuyéndose
i la acumulación en condiciones de crecimiento limitado de sustancias de reserva, funda-
nentalmente triglicéridos, en los que predominan los ácidos grasos saturados. A pesar de
:stos resultados alentadores, no son muchos los estudios que utilizan el estrés de nitrógeno
:n aras de producir lípidos. Por ejemplo, en el caso de Chaetoceros muelleri, se ha encontrado

i LiU
1 \i k i..li i , K) •!'•: A r>r:r: ¡: v i':: i• • n 11 ii:ci' .n di BiodicscJ

que en situación de depleción de nitrógeno, el contenido de lípidos es 4 a 7 veces superior a

su tratamiento control, aplicando como cepa potencialmente importante para la producción
de ácidos grasos con fines combustibles [33], Adicionalmente Engel et al \5A\ encontraron
que en esta especie aumenta la cantidad de lípidos intracelular en depleción de silicio, no
obstante, la tasa de crecimiento disminuye.

En otros estudios se apreció un significativo aumento en los contenidos de ácidos grasos,

mayor en los cultivos sometidos al burbujeo con aire. Se alcanzó en los cultivos sin nitróge-
no y con aire un contenido celular de ácidos grasos 3,18 veces superior al alcanzado en la
condición control y 1,93 al observado en los cultivos sin nitrógeno no burbujeados (Men-
doza, et al., Instituto Tecnológico de Canarias. Playa de Pozo Izquierdo, s/n 35119, Pozo
Izquierdo, Santa Lucía de Tirajana, Las Palmas, España). Este fuerte incremento en los
contenidos celulares en ácidos grasos, en respuesta a la supresión de nitrógeno en el medio,
coincidió con un fuerte aumento en el tamaño y el peso celular. Las células casi llegaron a
duplicar su peso, sin que se llegara a apreciar diferencias significativas debidas al burbujeo de
los cultivos. También se apreció una significativa pérdida de la motilidad celular, lo que, jun-
to al aumento del tamaño celular, puede constituir un fuerte determinante de la aplicación
de esta microalga en la elaboración de fitodietas vivas en acuicultura. Esto podría también
explicar el significativo aumento en el porcentaje de ácidos grasos saturados apreciado en
los cultivos sin nitrógeno, especialmente de los ácidos mirístico (14:0) y palmítico (16:0).

Deficiencias de otros nutrientes, además del nitrógeno, podrían ayudar al incremento del
contenido lipídico celular, es así como la falta de silicio por un período de 14 horas logra
incrementos del 60 % de lípidos, en laboratorio.

El cambio de acumulación de carbohidratos a lípidos ocurre muy rápido en las diatomeas,

por mecanismos que aún no están bien clarificados. Durante las primeras etapas de creci-
miento de los cultivos de algas, éstas producen un alto monto de lípidos polares y ácidos
grasos poliinsaturados como C16 y C l8 . En la fase de crecimiento estacionario se presentan
ácidos grasos 18:1 y 16:0. En el caso de las algas verde azuladas, la composición de lípidos v
ácidos grasos, muestra sólo pequeños cambios durante el ciclo de crecimiento.

Pero no sólo la nutrición influye en la composición lipídica, sino que otros factores como
la luz incrementan la formación de poliinsaturados C1(. y C l0 , así como esfingolípidos y fos-
fogücéridos en Euglenagracilis y Chlorella vulgaris respectivamente. Se ha visto además que las
bajas temperaturas incrementan la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados C para Mono-
crysis lutheri y también causa cambios en la composición de Dunaliella salina. El contenido de
glicerol es también influenciado por las condiciones del cultivo, particularmente las concen-
traciones de NaCl, donde los resultados muestran una relación inversamente proporcional
de la concentración de sal respecto al contenido de glicerol.

m | 48 |
Avances Investi^ativos en ia Producción de Biocombustibles

Aunque existen ventajas significativas en el aumento de lípidos por depleción de nitrógeno,

ésta podría causar modificaciones en los ciclos de crecimiento y reproducción, por ausencia
de sustrato de reparación proteica y construcción (nitrógeno esencial para la producción de
proteínas); así también como ocurre con el fotoperiodo. El encontrar un balance entre el
nivel de estrés sin que se demerite la producción de biomasa es un punto de partida impor-
tante para la producción de lípidos en cantidades industriales, aprovechando al máximo el
volumen disponible, buscando altas densidades celulares.

2.4.4. MODIFICACIONES DE LA FORMA DE CULTIVO

El aspecto económico de la producción de biodiesel limita su desarrollo y uso a gran es-
cala. El biodiesel cuesta más de 0,5US$/L, en comparación con los 0,35US$/L para el
combustible diesel convencional [35]. Las modificaciones debidas al uso de sustratos más
económicos para enriquecer los medios de cultivo de microalgas, tratadas con anterioridad,
no han logrado mejorar, en la mayoría de los casos, por mucho a los medios convencionales
de cultivo, si bien se han sostenido los rendimientos, y los costos pueden ser más menores
bajo condiciones de cultivo autótrofas (fototrópicas); sin embargo, la densidad celular y la
cantidad de lípidos sigue estando limitada a modificaciones en los patrones metabóücos de
las microalgas. De esta forma, se ha encontrado que algunas microalgas son capaces de cre-
cer además de en condiciones de fotoautotrofía, en mixotrofía (uso de una fuente de carbo-
no orgánico y energía luminosa como fuente de electrones) y heterotrofía (con una fuente
de carbono orgánico en la oscuridad); lo que en últimas hace más viable la producción de
biodiesel sin ciclos de luz/oscuridad controlados, o aumentados por medios artificiales, con
el consecuente uso de energía extra a la solar. Se ha reportado que Chlorella sp. utiliza com-
puestos orgánicos como fuente de carbono, principalmente: glucosa, galactosa y fructosa,
del medio de cultivo, para crecer heterotróficamente [36, 37, 38], así como también que esta
microalga es capaz de crecer mixotróficamente al usar energía luminosa y azúcares en forma
coordinada [39].

Las fuentes de carbono orgánico más comúnmente citadas para el crecimiento en cultivos
mixotróficos y heterotróficos son el etanol, el acetato y la glucosa. Se ha reportado que
Waematococcus pluviales puede sintetizar astaxantina en heterotrofía y mixotrofía utilizando
acetato de sodio como fuente de carbono. En ambos casos la concentración del pigmento
es mayor a la obtenida en condiciones de fotoautotrofía, debido en parte a que el acetato
promueve la obtención de mayores concentraciones celulares [40]. También se ha estudiado
la producción de a-tocoferol con Huglenagraális usando etanol como sustrato, la producción
del antioxidante aumentó hasta 2,9 veces con relación a lo obtenido en fotoautotrofía [41].

La investigación acerca de la capacidad de las microalgas para utilizar diferentes fuentes

de carbono orgánico es importante, debido a que permitiría el cultivo de microalgas en
biorreactores más convencionales {airlift o de columna aireada, por ejemplo), en los que el

I 49 I
I .as Microaliías. Fuente de Aceite para la Producción de r a o a i e s c i

aprovechamiento óptimo de la energía luminosa no es factible ya sea técnica o económi-

camente; sin embargo, éste es un campo de la biotecnología microalgal que se encuentra
en su desarrollo inicial. Otra especie de Chlorella ha sido estudiada utilizando el contro!
metabòlico por medio del crecimiento heterotrófico, con el fin de producir biodiesel poi
mecanismos de transesterificación; Xu et al. [42] afirman que para Chlorella protothecoides el
contenido crudo de lípidos se incrementa a un 55,2% en cultivos heterotróficos; en su es-
tudio, adicionalmente, para aumentar la biomasa y reducir el costo de la producción de k
microalga, se usó el hidrolizado de polvo de maíz en lugar de la glucosa como fuente de car-
bono orgánico en los fermentadores heterotróficos. Los resultados indican que la densidad
celular es significativamente mayor en virtud de la condición heterótrofa, y se alcanzó la más
alta concentración celular (15,5 g. L"1). Gran cantidad de aceite se extrajo en estos estudios
de manera eficiente mediante el uso de n-hexano, y se trasformò en biodiesel por transeste-
rificación àcida. El biodiesel obtenido por Xu et al. [42] se caracterizó por un elevado valor
calorífico (41 MJ kg 1 ), una densidad de 0,864 kg L 1 , y una viscosidad de 5,2 x IO'4 Pa s (a 40
°C). Así pues la forma de cultivos heterotróficos, tiene un gran potencial en la producción
industrial de combustible líquido de microalgas. De forma preliminar a este estudio, el cre-
cimiento de C. protothecoides fue evaluado suministrando acetato, glucosa u otros compuestos
orgánicos como fuente de carbono; los resultados determinaron incremento en la biomasa
y alto contenido de lípidos en las células [43, 44]. Con la adición de una fuente de carbono
orgánico (glucosa) al medio de cultivo y la disminución de la fuente de nitrógeno inorgánico,
el crecimiento heterotrófico de C. protothecoides, el contenido de lípidos fue hasta del 55,2%.
que es aproximadamente cuatro veces mayor que el contenido fotoantotrófico [45].

2.4.5. DISEÑO DE FOTOBIORREACTORES.

I .a infraestructura del cultivo microalgal es crucial para su óptimo funcionamiento, debid
básicamente a la respuesta a la dosis de energía luminosa sobre el microorganismo [46], LÍ
productividad teórica estimada de 100 toneladas anuales por hectárea de cultivos microal
gales no pudo ser alcanzada ni siquiera en los laboratorios de investigación, sino hasta prin
cipios de la década de los 90 [47]. Una limitante para lograr los estimados teóricos se debic
a que el sistema en carrusel, que inicialmente fue el mejor sistema para desarrollar cultivo:
en masa por su facilidad de construcción y operación, resulta inapropiado como punto di
partida para el desarrollo de sistemas de cultivo de alta productividad [46], y las densidade
celulares alcanzadas son del orden de los 0.7gfcel baseseca) /I [47]. Este sistema, ventajoso e
los costos de producción de biomasa algal, requiere de grandes áreas (gran inversión inicia
y, teniendo en cuenta un promedio de entre 4 al 20% en el contenido de lípidos en cond
ciones "ideales" de cultivo, esto se traduce en 0.028-0.14g/l de ácidos grasos; de tal formi
un cultivo de una hectárea de espejo de agua con una profundidad de 0.20m, contiene 200'
1 de medio de cultivo y producirían 56-280g de ácidos grasos en el sistema de carruse
producción bastante limitante para el desarrollo de cultivos microalgales masivos con fin
energéticos.

- I 50 |
El desarrollo de nuevos fotobiorreactores en forma tubular ha aumentado los niveles de
biomasa hasta alcanzar productividades volumétricas del orden de 640% superiores a los
convencionales por carrusel, pero los diámetros son limitantes (2,5cm) y el escalamiento
de esta tecnología básicamente funciona aumentando el número de tubos y su longitud,
pues una ampliación del diámetro genera una disminución en la producción de biomasa
[48] por disponibilidad energética menor y un aumento en la cantidad de oxígeno disuelto.
Flores et al. [43], indican que debido al entendimiento limitado de la curva dosis de ener-
gía luminosa-respuesta que presentan los organismos autótrofos y al estancamiento en la
utilización comercial del sistema en carrusel, los rendimientos de biomasa obtenidos en la
práctica fueron durante mucho tiempo considerablemente inferiores a los rendimientos
teóricos que se estimaban en los primeros años de la biotecnología algal. Sin embargo, esto
puede salvarse con diseños de fotorreactores cerrados con rutas luminosas pequeñas, con
dclos L/O (Luz/oscuridad) elevados y de frecuencia media o alta, con mezclado eficiente
y la utilización de unidades de filtración y ultrafiltración. Esto indica que para lograr altos
rendimientos de producción de biomasa y de lípidos microalgales con bajos costos, se re-
quiere usar sustratos alternativos para enriquecer medios de cultivo, optimizar el diseño de
formas de cultivo autotróficas incentivando bajos costos de inversión por modificaciones
de las técnicas (formas y sustratos nuevos para medios de cultivo) y tecnologías (diseños
de nuevos cultivos autótrofos o fotobiorreactores) y en conocer las especies de microalgas
Dresentes en los sitios donde se planea producir dichos microorganismos, pues éstas estarán
idaptadas a las condiciones climáticas reinantes en su medio de origen.

Hasta la fecha, tres grandes sistemas fofautotróficos se han desarrollado para el cultivo
de microalgas. Ellos son: (1) estanques abiertos (aire libre); (2) fotobiorreactores cerrados
que utilizan luz solar, y (3) fotobiorreactores cerrados, con diferentes diseños, que usan
luminación artificial [49]. El cultivo masivo de microalgas se origina con el desarrollo de
estanques abiertos, la más antigua y sencilla de las tecnologías, en la que los sistemas de ai-
ras son cultivadas en condiciones idénticas al medio ambiente natural. En general, la escala
:omercial de los estanques abiertos es difícil a causa de problemas con la contaminación no
leseada por las microalgas distintas al cultivo, bacterias y protozoos depredadores. Además,
as condiciones de cultivo óptimas son difíciles de mantener en estanques abiertos y la recu-
jeración de biomasa en un cultivo diluido como éste es costosa [50], Como resultado, sólo
inos pocos géneros de algas que crecen en un entorno especializado y selectivo se han cul-
ivado en estanques abiertos. Cohén y Heimer [51] informaron que la productividad de EPA
ácido eicosapentanoico) de Porphjridium cruentum en estanques abiertos sólo fue de 0,5 mg
s 1 día 1 en invierno y 1,0 mg L 1 día 4 en verano. Se estima que la productividad de EPA en
istanques abiertos puede sólo de 4-8 mg L 1 día 4 en el mejor de los casos [52]. Bajo ciertas
:ondiciones, los cultivos con mayor densidad celular, son capaces de utilizar la luz incidente
:on mayor eficiencia en comparación con cultivos convencionales diluidos. Hu et al. [52]
ían reportado que al reducir la trayectoria de la luz se obtiene un aumento significativo de la

• ¡ ^ H H B H B H H H H a V ' | 51 | " « • • • • • • • • • • H ^ i
I .as M l e r n a In l u c u t e d e A c e i t e p a t a ¡a P r o d i nx¡< 111 d e B i o d i c s e . 1

densidad celular óptima y de la velocidad específica de crecimiento. En un fotobiorreacto

de plano inclinado estos autores observaron además que con una trayectoria de la luz di
10,4cm, la productividad fue sólo 6% de la obtenida en otro reactor con una trayectoria d
la luz de l,3cm.

ELn fotobiorreactores tubulares, se han reportado resultados similares al reducir la trayec-

toria de la luz. Richmond et al. [48] usando un nuevo diseño de reactor tubular horizontal
reportaron un aumento de 77% en la productividad volumétrica cuando el diámetro del
tubo disminuyó de 5 a 2,8cm. ] .a productividad en este último caso fue 640% superior a
la obtenida en un sistema convencional de carrusel con 15cm de profundidad. Las rutas
luminosas que mejores resultados han dado en diferentes fotobiorreactores están entre 2,6
y 3,0cm; sin embargo, en cultivos de alta densidad celular, una trayectoria de la luz de lem
aumenta la probabilidad de que las células en promedio estén expuestas a un régimen de
iluminación óptimo [53], En virtud de lo anterior, actualmente no es recomendable utilizar
rutas luminosas de más de l()cm en ningún tipo de biorreactor. Otros adelantos en el diseño
de fotobiorreactores se encuentran en los aportes de Richmond [54], el cual recomiend
una iluminación intensa (mediodía), el uso de reactores con una trayectoria de la luz pe-
queña, y un mezclado vigoroso hasta donde lo permita la fragilidad de las células. Por otr
parte, Grobbelaar [55] determinó experimentalmente la contribución de los ciclos L/O }
de la transferencia de nutrientes, y concluyó que los dos componentes del mezclado actúa
sinèrgicamente sobre la productividad. Una frecuencia alta o mediana de ciclos L/O ayud;
a evitar la fotoinhibición, aún a niveles elevados de iluminación, debido a que las células nc
están expuestas permanentemente a la luz [59]. La tasa de fotosíntesis y la productivida
de los cultivos aumentó al aumentar la frecuencia de los ciclos L/O en el intervalo de 0,05
5000Hz. La metodología empleada podría adecuarse para optimizar los ciclos L/O en dife
rentes especies de algas. Finalmente, para lograr cultivos de Ultra Alta Densidad (UADC) si
han utilizado diversas geometrías de fotobiorreactores y fuentes de iluminación, tales com<
reactores planos verticales con lámparas fluorescentes de luz blanca (Hu et al., [56]), reac
tores iluminados cuasi-internamente por diodos [57], reactores iluminados internament
mediante fibra óptica [53], y reactores planos inclinados con iluminación solar mantenido
en exteriores [56],

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^^^^ Avances Investigativos en la Pirxiuc

CAPÍTULO 3

BIOCATÁLISIS MEDIANTE CÉLULAS

APLICACIÓN A LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL

Carlos Eduardo Orrego Alzate*,

Óscar Darío Hernández Parra,
Diana Marcela Cetina Medina

INTRODUCCIÓN
Los procesos de fermentación tradicionales se usan principalmente para la transformación
de fuentes de carbono renovables en productos naturales bioactivos. Las fermentaciones
utilizan células vivas para transformar materias primas como azúcares, almidones o meta-
nol, presentes en mezclas industriales tales como melazas, en compuestos más complejos
como alcoholes, cetonas, vitaminas, antibióticos, aminoácidos y otras moléculas orgánicas
no quirales [1],

Una transformación biocatalítica (mediante células completas o enzimas) puede ubicarse

en el camino intermedio entre un proceso fermentativo convencional y una transformación
petro o carboquímica. Se alimentan moléculas precursoras para que el biocatalizador las
transforme en el compuesto deseado mediante un número limitado de pasos funcionales
(no siempre dilucidados). Las fuentes de carbono y de energía que requiere el biocatalizador
normalmente no vienen de materias primas fácilmente metabolizables como son los azú-
cares. La variedad de productos en estos casos tampoco está limitada por el metabolismo
del biocatalizador: las moléculas precursoras pueden ser distintas de los sustratos conven-
cionales, pues en general estos biocatalizadores pueden transformar compuestos naturales
y no naturales. Se pueden obtener por esta vía moléculas quirales o biopolímeros como
proteínas, ácidos nucléicos o carbohidratos [1, 2].

Generalmente se supone que cuando se habla de un biocatalizador en una reacción par-

ticular se hace referencia a una enzima purificada que, sin excepción, proviene de alguna

* Universidad Nacional de Colombia-Sede Manuales, Plantas Piloto de biotecnología y Agroindustria, Campus La Nubia, Mani^aks,
AA 127, Colombia
Tel-fax: +57-68879400 Ext. 55880.E-mail: [email protected]

— ^ ^ I 57 | — —
Biocatálisis M e d i a n t e Células Aplicación a la Producción de liiodiesel

fuente biológica, sea una planta, bacteria o animal. Sin embargo, siempre existe la alternativa
de utilizar organismos simples como bacterias u hongos como fuente de las enzimas que
realizan la conversión de interés.

A continuación se presenta el panorama general de trabajos publicados recientemente sobre

el uso de biocatalizadores de células completas, ya sea usados en forma directa o luego de
inmovilizarlos sobre soportes, para la obtención de diferentes productos, con énfasis espe-
cial en los sistemas catalíticos que se han aplicado en la producción de biodiesel.

3.1 .VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL USO DE BIOCATALIZADORES

DE CÉLULAS COMPLETAS (BCC)

En la tabla 3.1 se hace una síntesis de las principales ventajas y desventajas que conlleva el
uso de los BCC.

Tabla 3.1. Ventajas y desventajas del uso de BCCs

Ventajas Desventajas
Mientras que las enzimas que se pueden usar Los procesos de transformación son más
están usualmente limitadas a las disponibles en complicados y son mas demorados, pues hay que
el mercado, el uso de un BCC sólo está diseñar la etapa de crecimiento celular y la de
restringido al número de microorganismos que conversión de sustratos
nueden cultivarse
El costo de fermentar es generalmente menor Si se usa un BCC sin inmovilizar el react or
que el precio de una enzima comercial o el gasto contiene simultáneamente al menos sustratos,
para purificar una enzima productos y medios de crecimiento, lo que
dificulta las etapas posteriores de purificación de
los materiales aprovechables
En una reacción redox p. ej. no se requiere de la Puede haber otros subproductos por la
adición de un cofactor al medio de reacción pues presencia de otras enzimas en la célula
las células oueden reciclarlos
Si la enzima no se secreta se requiere de lisis
celular o asegurarse de dar condiciones para el
transporte de sustratos y productos a través de la
Dared celular

Cuando se trabaja con una enzima purificada usualmente su caracterización es conocida o

es fácil de hacer. Dentro de tal caracterización se incluyen las condiciones óptimas de ope-
ración (pH, temperatura, etc.) y la actividad específica de la enzima. Por el contrario, cuando
se hace uso de los BCCs en cada caso pueden actuar una variedad de enzimas intra o extra-
celulares que secreta el microorganismo, de las que generalmente no hay disponible sino
información parcial, en el mejor de los casos. Tal situación hace que los estudios básicos que
conlleven a modelos cinéticos con fines de diseño de procesos sean más dispendiosos que
los que se hacen para catálisis mediante enzimas.

| 58 | «a
Avances tnyestfoauvos en la P r o d u c c i ó n de P " S u a i i h l t s

A pesar de estos inconvenientes, de la lentitud de los procesos y las demás desventajas men-
cionadas en la tabla 3.1, actualmente, por razones principalmente económicas, se utilizan un
poco más los procesos catalíticos de transformación con células inmovilizadas que los que
usan enzimas purificadas [9].

Unos pocos ejemplos de las amplias opciones que ofrecen los BCCs, especialmente en la
industria farmacéutica y de aromas, se muestran en la tabla 3.2.

Tabla 3.2. Productos comerciales obtenidos mediante BCCs

Producto Microorganismo Enzima(s) Ref

Acido(S)-2-
cloropropiónico Pseudomonas sp. Dehalogenasa Avecia [3]
Lisina-aminotransferasa
Acido L-Pipecólico Recombinante de E. (dsFlavobacterium lutescenns). Mercian
coli Pirrolina-5 -carboxilato. [4]
reductasa (de E. coli)

Glutation Recombinante de E. Kyowa

glutatión sintetasa (de E. coli) en
coli generación de ATP Hakko [5]
Rhodococcus
Nicotinamida Nitril hidratasa Lonza [6]
rhodochrous J1
L-Amino ácidos Recombinante de E.
L-Hidantoinasa yL-carbamoilasa Degussa [V]
coli
Acidos carboxílicos Gluconobacter Haarmann
(propiónico, butírico, oxydans, Acetobacter & Reimer [8]
isobutírico) pasteurianus GmbH

3.2. BCCS EN MEDIOS ORGÁNICOS

Los disolventes orgánicos son muy tóxicos para casi todos los microorganismos y sus en-
zimas. Su presencia, aún en concentraciones tan bajas como 0.1% (v/v), puede destruir o
inactivar sus células y enzimas [10]. Algunas bacterias tolerantes a estos ambientes pueden
contrarrestar sus efectos tóxicos gracias a mecanismos de bombeo proteináceos, reparación
muy rápida, reducción de la permeabilidad e incremento de la rigidez de la membrana y
descenso de la hidrofobicidad de la sunerficie celular [11],

La primera información publicada sobre una bacteria tolerante a disolventes orgánicos fue la
de Inoue and Horikoshi en 1989 [12] quienes descubrieron una cepa de Pseudomonas putida
(IH-2000) que era capaz de crecer y multiplicarse en un medio con 50% (v/v) de tolueno. A
partir de ese momento comenzaron a producirse profusos informes sobre bacterias,

I 59 I m
Biocatálisis Mediante Células Aplicación a la Producción de liiodiesel

principalmente Vseudomonas con alta tolerancia a disolventes (tales como xileno, estireno
y tolueno). Otras bacterias que resisten disolventes no acuosos son algunas cepas de
Bacillus, and Rhodococcus [13-15].

La membrana celular, una bicapa de fosfolípidos en la que están embebidas enzimas y pro-
teínas de transporte, es el primer sitio que afectan los disolventes orgánicos, penetrándola
y rompiéndola, comprometiendo de esta forma la viabilidad celular [16], Debido a que las
bacterias Gram-negativas tienen una membrana exterior adicional, están mejor preparadas
que las Gram-positivas contra el proceso agresivo que inducen los disolventes [17],

La recuperación de los productos en un medio acuoso es difícil. Un sistema promisorio

que facilita estas separaciones es del manejo de sistemas bifásicos en el que un disolvente
orgánico actúa como segunda fase. Mediante esta técnica en la fase acuosa se encuentra el
microorganismo y la segunda fase no acuosa hace las veces de depósito de los sustratos y
de los productos de reacción. De esta manera la concentración de los sustratos en el sis-
tema completo puede ser alta mientras que si tienen baja solubilidad en la fase acuosa, su
presencia allí puede estar por debajo de los niveles inhibitorios. Igualmente el o los produc-
tos se particionarán en la fase del disolvente previniendo la inhibición o su posible efecto
tóxico [18-20],

3.3. ESTABILIDAD DE LOS BIOCATALIZADORES DE CÉLULAS

COMPLETAS-BCC-

Esta importante característica en la biocatálisis industrial ha sido investigada para estos

sistemas en la producción de combustibles y productos químicos. A continuación se re-
lacionan algunas de las técnicas que se han utilizado con el propósito de incrementar la
estabilidad de los BCCs.

Ban y colaboradores [21] encontraron que se puede mantener una alta actividad catalítica
durante muchos reusos en un BCC que ha sido entrecruzado con glutaraldehído biocata-
lizador. En contraste, las células que no recibieron tal tratamiento muestran una activida
decreciente a medida que se reutiliza.

Oda y colaboradores [22] reportaron que, además de obtener mayor contenido de ésteres
metílicos, la durabilidad de un BCC cultivado en un reactor de arrastre o airlift era superio
a la mostrada en un erlenmeyer agitado.

Varios estudios han señalado que los ácidos grasos afectan las propiedades de la membran
plasmática, alterando su permeabilidad [23-25] y la estabilidad de un BCC [26], Los ácido

fi —• /1 M i I - as
— Avances Investigativos en la Producción de Biocombustibles

grasos incrementan la permeabilidad y la rigidez de la membrana celular, lo que incrementa

la actividad de matanóüsis y la estabilidad de la enzima.

Finalmente, la adición de ter-butanol dilata la estabilidad de los BCC de R. oryzae en la

producción de biodiesel. Con este método también se reduce el tiempo de reacción. Este
efecto se atribuyó a la mejor transferencia de masa del sistema con ter-butanol con respecto
del que no usa disolvente [27],

3.4. BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS

Algunos de los problemas que se tienen con los BCCs se pueden superar si las células se
inmovilizan. Los biocatalizadores inmovilizados son enzimas, células u organelos (o com-
binación de ellos) confinados o localizados en cierta región definida del espacio, con reten-
ción de su actividad catalítica y, si es necesario, de su viabilidad, y que pueden ser usados de
modo repetido y continuo [28], Para obtener biocatalizadores inmovilizados que retengan
actividad y sean estables, se usan métodos de inmovilización semejantes a los descritos para
las enzimas como el entrecruzamiento físico, el entrecruzamiento covalente, la adsorción
sobre matrices insolubles, el enlace covalente con matrices insolubles, el entrampamiento
físico en materiales porosos o el encapsulamiento. En los dos primeros casos las células
son unidas con otras células, tanto por adsorción o por uniones. Cuando se usan matrices
insolubles tales soportes deben cumplir una serie de requisitos como son disponer de una
alta superficie, idealmente con grupos funcionales a los que las células se puedan enlazar, ser
fáciles de manipular y regenerar, permitir que la viabilidad, la actividad biológica celular y la
estabilidad operacional del biocatalizador sean altas y durables, ofrecer porosidad uniforme
y suficiente para el flujo de sustratos, productos, cofactores y gases y ser estable química,
mecánica y térmicamente [29, 30].

La inmovilización de células para obtener biocatalizadores es una práctica conocida en la

industria de bebidas alcohólicas desde finales del siglo pasado, pues allí se le han encontra-
do numerosas ventajas tales como la mejoría de la productividad en las fermentaciones, la
posibilidad de operan, procesos continuos, una mayor estabilidad celular y la reducción de
costos en la recuperación, el reprocesamiento y los procesos de separación posteriores a la
fermentación [31-33], En un ámbito amplio de bioprocesos se han publicado numerosos
estudios que también hacen uso de microorganismos tales como bacterias, levaduras y hon-
gos como biocatalizadores con células completas, intentando con ello hacer reducciones en
los costos de estos procesos de transformación [34, 35],

•r | 61 |
Biocatálisis M e d i a n t e Células Aplicación a la P r o d u c c i ó n de liiodiesel

3.5. CÉLULAS INMOVILIZADAS SOBRE PARTÍCULAS DE BIOMAS

(CPB)
Desde que el concepto de inmovilización de células sobre partículas de biomasa (CPB) fu
introducido por Atkinson y colaboradores [36], esta sencilla técnica se ha aplicado muy
intensamente. Miura y Yamane [37] hicieron un extenso estudio sobre las alternativas par
la producción de lipasas a partir de células de hongos filamentosos inmovilizados en CPPS,
trabajo que ha sido continuado por otros investigadores, tanto para la producción de lipasa
[38] como de otras enzimas como la fosfolipasa D [39].

3.6. USOS DE CPBS CON LIPASAS

Los procesos de separación, purificación e inmovilización, necesarios para la fabricación
y comercialización de una lipasa extracelular, constituyen más del 70% de sus costos de
producción [40, 41]. Consecuentemente, las lipasas comerciales tienen actualmente un alt
precio lo que limita enormemente su aplicabilidad como catalizadores para biocombustibles
y otros productos químicos. Este hecho ha motivado la investigación en el uso directo d
microorganismos como bacterias, levaduras y hongos que, inmovilizados sobre soportes
adecuados, pueden desempeñarse como catalizadores siempre que en su superficie celulai
estén presentes las proteínas que hagan la función catalítica [42].

Dentro de los sistemas biocatalíticos de células completas inmovilizadas que se han proba-
do, los hongos filamentosos son los que aparecen como más promisorios para aplicacione
industriales. Nakashima et al. estudiaron la interesterificación y la metanólisis de aceites
vegetales inmovilizando Rhi^opus chinensis [43, 44]. A ese mismo hongo filamentoso lo culti
varón sobre partículas de espuma de poliuretano que, luego de deshidratadas, se utilizaro
como biocatalizador en la interesterificación continua de varios aceites y grasas [45], Co
este tipo de inmovilización el K chinensis incrementó la actividad específica de su lipas;
extracelular entre cuatro y siete veces respecto de la que mostró cuando estaba en form;
de células suspendidas [42], Tal efecto se atribuye a que la agregación celular asociada a 1:
inmovilización incrementa la producción de lipasas en las especies Rhi^opus [46, 47].

3.7. CONDICIONES DE INMOVILIZACIÓN DE CPBS CON LIPASAS

La mayor parte de los trabajos que han sido publicados en los que se inmovilizan células qui
producen lipasas, utilizan la espuma de poliuretano como soporte. Como se mencionó, la
partículas de biocatalizador se han tratado algunas veces con disoluciones de glutaraldehíd(
para incrementar su estabilidad operacional. En la tabla 3.3. se muestran algunas de las co
diciones reportadas en los protocolos de fabricación de los CPPS de este tipo.

I 62 |
• • v.s investigativo-. en la Producción de Biocornbusdbìes

Tabla 3.3. Condiciones de cultivo y tipo de soporte utilizados en la producción de algunos

CPPS con microorganismos productores de lipasas

Microorganismo Condiciones de CPB Observaciones Referencia

cultivo
R. oryzae En 1 litro de agua Cubos de 6 m m L a actividad de las [21]
(pH 5.6): polipepton de espuma de células cuando se
70 g; N a N 0 3 1.0 g; poliuretano trataron con solución
K.H2P04 re ti culada de Glutaraldehído —
G A - 0 . 1 % no mostró
1.0 g; (Bridgestone Co. decremento
M g S 0 4 • 7 H 2 0 0.5 Ltd., Osaka, significativo durante
g; aceite de oliva 30 Japón) con una seis ciclos por lotes (el
g. A 35 °C por 90 h porosidad de contenido de metil
en un agitador partícula del 9 7 % éster alcanzó 70 —83%
reciproco (150 y un tamaño de en cada ciclo). Sin
osci íaciones/min, poro de 50 poros tratamiento con GA la
por p u l g a d a actividad decreció.
amplitud 70 m m ) lineal.

R. miehei M e d i o Czapek ( 2 5 0 20, 50 o 75 1CBP El mejor portador para [48]

c m 3 ) con sebo de Poliuretano o inmovilizar lipasas
cordero ( 0 . 5 % espuma de intracehilares f u e
(v/v)), glucosa polipropileno con espuma de poliuretano,
( 0 . 5 % (w/v)), 48 h a una porosidad de y la actividad lipolítica
4 0 °C, pH inicial 0.97, ( 1 2 m m de las lipasas
4.5, 2 5 0 rpm *6mmx6 mm) inmovilizadas fue 2.1 -
4.3 v e c e s m á s alta que
Y tipolytica M e d i o Barnes (250 50, 100 o 150 la actividad obtenida
c m 3 ) con sebo de ICBP poliureta no de biomasa libre.
cordero ( 0 . 5 % o espuma de
(v/v)), glucosa polipropileno con
( 0 . 5 % (w/v)), 4 8 h a una porosidad de
25 °C, pH inicial 0.97, ( 1 2 m m
4.5, 2 5 0 rpm x 6 m m x 6 mm)

Microorganismo C o n d i c i o n e s de LTH Observaciones Referencia

cultivo
R. oryzae Potipeptona, 7 0 g ; 150 CBP, cubos Células de R. oryzae [47]
N a N 0 3 , 1.0 g ; de 6-min de producen dos tipos de
K H 2 P 0 4 , 1.0 g ; poliuretano lipasas de diferentes
M g S 0 4 . 7 H 2 0 , 0.5 g reti cui ado o m a s a s moleculares de
en 1L de agua espuma de 3 4 y 3 1 kDa. La
destilada, 3 0 ° C por poliuretano con adición de aceite de
24—120 h en un una porosidad oliva al medio de
agitador reciproco de partícula de cultivo permitió la
(150 m á s de 9 7 % y retención d e cantidades
osci 1 aciones/min; un tamaño de superiores d e lipasa
amplitud, 70 m m ) poro de 50 dentro de la célula.
poros por
pulgada lineal.

R. oryzae 1 1 de a g u a : 30 g de Cubos de 5 m m Aceites de colza [27]

aceite de soya, 7 0 g de poliuretano retinados, crudos y
reti cu lado o acidificados, fueron
peptona, 1.2 g espuma de usados para producción
N a N 0 3 , 1.2 g poliuretano co n de biodiesel en ter
K H 2 P 0 4 and 0.5 g una porosidad butanol. L a velocidad
MgS04.7H20. d e partícula por de reacción incrementó
encima del 9 7 % con el con tenido de
y un tamaño de ácidos grasos libres y
poro d e 50 fosfolípidos en los
poros por aceites.
pulgada lineal
R. oryzae 1% glucosa/aceite de
oliva, polipeptona
Espuma de Los biocatalizadores [49]
po liuretano fueron incubados con
7 0 g, N a N 0 3 1.0 g, reticulado con solución al 0.1 vol.%
KH2P04 una porosidad de glutaraldehído ( G A )
de partícula de a 2 5 «C por 1 h. El
1.0 g y m á s del 9 7 % y m á x i m o contenido de
M g S 0 4 - 7 H 2 0 0.5 g un tamaño de metil ésteres, fue de 8 0
en 1 1 de agua poro de 50 w t . % después de 60 h y
destilada. poros por el 7 6 % después de 9 0 h
p u l g a d a lineal. usando N o v o z y m 4 3 5 .

« | 63 | a
ßioctälsj^ /^Ikaxnón a j a P r o d u c c i ó n d e Biod ese

3.8. CPBS CON LIPASAS PARA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL

En la tabla 3.4. se relacionan en forma simplificada varias condiciones de reacción y sustra
tos utilizados en la producción de esteres metílicos de ácidos grasos con BCCs y CPBs.

Tabla 3.4. Algunas condiciones de reacción y sustratos utilizados en la producción de ásteres metílicos
de ácidos grasos (ME) mediante catálisis con células inmovilizadas en partículas de biomasa (CPB)
o biocatalizadores de células completas (BCC)
CPB o BCC 1 Sustratos/solvente Condiciones de reacción Referencia
R. oryzae — Aceite de soya- ME: 80-90%, 72h, 32°C [41]
poliuretano metanol/Ninguno
R. oryzae - Aceite de soya- ME:90%, 48h, 35°C [50]
poliuretano metanol/Ninguno
R. oryzae - Aceite de soya- ME:72%, 35°C [51]
poliuretano metanol/t-butanol
R. oryzae - Aceite de Jatropha- ME:89%, 60h, 30°C [49]
poliuretano metanol/Ninguno
R. oryzae — Aceite refinado de
poliuretano colza/metanol/t- ME:60%, 24h, 35°C [27]
butanol i
R. oryzae — Aceite de cañóla
poliuretano crudo-metanol/t- ME:60%, 24h, 35°C [27]
butanol
R. oryzae — Aceite de cañóla
poliuretano refinado-metanol/t- ME:70%, 24h, 35°C [27]
butanol i
Pseudomonas Aceite de Jatropha- ME:71%, 40°C, pH of 7.0, 1
fluorescens -sodium metanol/TMmguno relación molar 1.4, cantidad [52]
alginate de lechos 3 g , 48 h
R. oryzae — Aceite de cañóla
poliuretano acidificado - ME:60%, 24h, 35°C [27]
metanol/t-butanol
Mycelium of R. Aceite de soya- ME: 86%, 72h [53]
Chinensis metano 1/Ninguno
5. cerevisiae Aceite de soya- ME: 71%, 165h, 37°C [54]
(ROL intracellular ) metanol/Ninguno
S.cerevisiae Aceite de soya- ME: 78%, 72h, 37°C [55]
(ROL intracellular ) metano 1/Ninguno
E. Coli expresando Aceites de soya, ME: 84-96%, 12h, 15°C,
lip Kl 07. 2% polvo colza, palma, 180 rpm, relación molar
célula (basado en el higuerilla, maní, aceite/metanol 1:5, adición [56]
peso del aceite) girasol, maíz y en un solo paso, contenido
Jatropha curcas L- de agua 100%
Metanol/Ninguno

El hongo filamentoso que ha sido objeto de más estudios en la metanólisis de aceites v<
getales catalizada por lipasas es el Rhi^opus oryzae, que originalmente produce una lipasa e:
pecífica para la posición 1,3 de los TAG [26, 27]. Este microorganismo se usó en el primi
reporte publicado de un biocatalizador de células completas para la producción de biodies
que fue el de Ban y colaboradores [41] quienes usaron miscelio de R. oryzae imovilizad

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" ' .nvesijganvns en la Prnuucción de Biocombusribles

sobre partículas de espuma de poliuretano. Investigaron además las condiciones óptimas

de cultivo para la producción de lipasa y el efecto de los métodos de pre-tratamiento y el
contenido de agua en la metanólisis.

Es interesante resaltar que la adición de aceite de oliva y ácido oleico al medio de cultivo
aumenta significativamente la actividad de K ory^ae en poliuretano [47] que, además, cuando
se usa en reactores de lecho empacado puede ejercer mejor su función catalítica mediante la
adición de cierta cantidad de agua, alcanzando conversiones a ésteres metílicos en el inter-
valo 80-90% durante 10 ciclos[50],

CONCLUSIONES
Las biotransformaciones industriales han permitido una revolución biotecnológica debido
a su selectividad y eficiencia. Por ejemplo, las enzimas catalizan la producción de compo-
nentes estereoespecíficos y regioespecíficos y producen en mayor cantidad isómeros puros
que mezclas. Así mismo, el nivel de polución causado es mucho menor comparado con el
que producen los catalizadores químicos. Los sistemas biologicos son capaces de superar
grandes desafíos. Sin embargo, aún no existen muchas aplicaciones industriales debido a la
fragilidad de los catalizadores. A pesar de que los catalizadores de células completas ofre-
cen ventajas económicas y ambientales, sobre las enzimas libres, la impredecibilidad de las
reacciones evita que sean usados más ampliamente como catalizadores a nivel industrial.
Para su uso eficiente algunos problemas se deben tomar en consideración (por ejemplo, la
permeabilidad de los sustratos a través de la membrana celular, las reacciones secundarias
que causan la degradación de los productos, la acumulación de coproductos, etc).

A pesar de estos inconvenientes, hay una gran actividad investigativa en el uso de biocata-
lizadores de células completas pues, aunque hay gran cantidad de enzimas y microorganis-
mos conocidos, faltan todavía muchos por conocer, considerando su amplia distribución
en la naturaleza.

En el caso de la producción de biodiesel, la mayoría de los problemas asociados a la catálisis

con álcalis pueden ser superados empleando transesterificación enzimàtica. Los biocatali-
adores de células completas pueden proveer aún más ventajas que los procesos enzimáti-
cos convencionales, permitiendo métodos de preparación del catalizador menos costosos y
mejor estabilidad operacional. Sin embargo, el alto tiempo de reacción es aún un problema
ue se debe superar.

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Avances Investigativos en la Producción de Biocombustible

CAPÍTULO 4

PRODUCCIÓN DE BIODIESEL UTILIZANDO

TECNOLOGÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS

Diana Catalina Cubides R,

Carlos Ariel Cardona A*.

Introducción
En los últimos años ha aumentado la necesidad de procesar materias primas baratas, tales
como aceites usados, insaturados, grasas animales y de descarte, con el fin de bajar los cos-
tos de producción del biodiesel, cuya obtención se basa actualmente en el procesamiento
de aceites vegetales de alto costo. Estas materias primas alternativas poseen alta acidez y
han motivado opciones al proceso clásico catalizado por bases, como: la pre-neutralización
de los ácidos grasos libres presentes en la alimentación, la pre-esterificación de los ácidos
grasos libres con metanol o glicerina (catalizada por ácidos fuertes, seguida de esterificación
en medio alcalino), o la esterificación catalizada completamente por ácidos [1].

Los procesos catalizados por bases (NaOH, KOH) o por ácidos (H2S04) demandan etapas
de lavado para eliminar el catalizador y esto produce grandes cantidades de efluentes [2].
Otra importante alternativa propuesta para trabajar con materias primas de baja calidad es
la transesterificación en condiciones supercríticas [3; 4], cuando se habla de condiciones
supercríticas en la producción de biodiesel pueden presentarse varios escenarios, el primero
es que la mezcla de reactivos, en este caso el aceite y el alcohol, se encuentren ambos en
estado supercrítico, sin embargo, a medida que éstos reaccionan cambian las condiciones
necesarias para que la mezcla se considere supercrítica. Otra alternativa es que sólo uno
de los componentes de la mezcla, ya sea reactivo o producto se comporte como un fluido
supercrítico, o finalmente puede usarse un solvente que se encuentre en estado supercrítico
y modifique la solubilidad de una o más sustancias de la mezcla, lo cual altera la velocidad
de la reacción.

Los procesos para producir biodiesel en condiciones supercríticas pueden clasificarse en ca-

* Universidad Nacional de Colombia-Sede Maníjales, Plantas Piloto de Biotecnologíaj Agroitidustria, Campus la Nubia, Maníjales, AA
127, Colombia. Tel-fax: +57-68879400 Ext. 55880.E-mail: [email protected]

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